CY3-DUTP是一種將三碳菁（CY3）熒光染料與脫氧尿苷三磷酸（DUTP）共價(jià)結(jié)合的核苷酸類似物，可在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)酶促摻入核酸鏈，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定核酸序列的熒光標(biāo)記。其結(jié)構(gòu)特性與光譜性質(zhì)使其在基因探測(cè)、原位雜交及熒光成像等應(yīng)用中能夠提高檢測(cè)的靈敏度與信號(hào)穩(wěn)定性。
CY3屬橙紅色熒光染料，具有可被常見(jiàn)熒光檢測(cè)系統(tǒng)高效激發(fā)與接收的發(fā)射波長(zhǎng)范圍。與DUTP結(jié)合后，保留了核苷酸的堿基配對(duì)能力與酶識(shí)別位點(diǎn)，因而可在DNA或RNA聚合酶的催化下替代部分dTTP摻入正在合成的核酸鏈。在探針制備中，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄或隨機(jī)引物標(biāo)記等方法，使它進(jìn)入探針序列，從而在后續(xù)與靶序列雜交時(shí)發(fā)出可檢測(cè)的熒光信號(hào)。由于熒光基團(tuán)直接連于核苷酸，標(biāo)記過(guò)程在分子水平上均勻分布，避免了后期化學(xué)偶聯(lián)可能造成的活性位點(diǎn)遮蔽或標(biāo)記不均。
提高基因探測(cè)靈敏度的關(guān)鍵在于信號(hào)強(qiáng)度與背景噪聲的平衡。CY3的熒光量子產(chǎn)率較高，單位摻入量可產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)，這有利于檢測(cè)低豐度靶序列。其光穩(wěn)定性較好，在常規(guī)激發(fā)與采集條件下不易發(fā)生明顯光漂白，可在成像過(guò)程中保持信號(hào)持續(xù)性，減少曝光時(shí)間與檢測(cè)誤差。探針中摻入比例可優(yōu)化，使每條探針攜帶適量熒光基團(tuán)，既保證信號(hào)強(qiáng)度又避免過(guò)度標(biāo)記引起的空間位阻或雜交親和力下降。
在應(yīng)用方法上，廣泛用于DNA探針標(biāo)記。原位雜交實(shí)驗(yàn)中，CY3標(biāo)記的探針可定位細(xì)胞或組織切片中的特定核酸序列，熒光信號(hào)可直接在顯微鏡下觀察，適用于基因表達(dá)定位與染色體異常檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR雖較少直接使用CY3-DUTP，但在某些終點(diǎn)法檢測(cè)或熔解曲線分析里，可利用其摻入的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光掃描，輔助產(chǎn)物鑒定。流式細(xì)胞術(shù)中，將其摻入細(xì)胞內(nèi)的核酸可用于細(xì)胞周期與增殖狀態(tài)分析，其橙紅信號(hào)可與其它熒光通道區(qū)分，便于多重標(biāo)記。
使用它需注意摻入效率與標(biāo)記均勻性控制。在酶促標(biāo)記反應(yīng)中，dTTP與CY3-DUTP的比例需根據(jù)探針長(zhǎng)度與所需標(biāo)記密度優(yōu)化，比例不當(dāng)可能導(dǎo)致?lián)饺氩蝗蛱结樆钚越档?。?biāo)記后需通過(guò)純化去除未摻入的游離染料，防止游離熒光分子在檢測(cè)中增加背景。不同緩沖體系與離子強(qiáng)度可能影響聚合酶活性與染料穩(wěn)定性，應(yīng)篩選適宜的反應(yīng)條件。雜交與洗滌步驟應(yīng)優(yōu)化溫度和鹽濃度，以降低非特異性結(jié)合引起的背景熒光。
在保存與使用過(guò)程中應(yīng)避免強(qiáng)光直射與反復(fù)凍融，以防染料降解或摻入能力下降。溶液宜避光、低溫保存，并在規(guī)定期限內(nèi)使用，以保持熒光性能。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)結(jié)合檢測(cè)系統(tǒng)的光譜配置，避免與其它熒光染料串?dāng)_，必要時(shí)采用順序激發(fā)或光譜拆分算法提高特異性。
CY3-DUTP憑借穩(wěn)定的熒光特性與直接的酶促摻入方式，使核酸探針標(biāo)記更為高效與均勻，在基因探測(cè)相關(guān)方法中能夠有效提升信號(hào)強(qiáng)度與檢測(cè)靈敏度，成為分子生物學(xué)與細(xì)胞分析中常用的熒光標(biāo)記物。
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